①Método de determinación de nitrógeno de Kjeldahl
Principio: El contenido medio de nitrógeno de las proteínas es 16. Cuando la muestra se calienta con ácido sulfúrico concentrado, el nitrógeno proteico se convierte en sal de amonio. El amoníaco se evapora en condiciones alcalinas fuertes y se absorbe con ácido bórico con un indicador. Finalmente, el ácido bórico se titula con ácido estándar. El ácido estándar es el contenido de nitrógeno y el contenido de proteína en la proteína.
②Método Biuret
Principio: la urea se desamina a 180 °C para formar biuret, que puede formar un complejo estable de color rojo púrpura con Cu2 en una solución alcalina. Los enlaces peptídicos en las proteínas son en realidad enlaces amida, por lo que los polipéptidos, proteínas, etc. tienen reacciones de biuret, que producen complejos azules o morados. Determinación colorimétrica del contenido de proteínas.
Desventajas: baja sensibilidad, la muestra debe ser soluble y el desarrollo del color no es bueno en presencia de grandes cantidades de carbohidratos y péptidos que contienen prolina. Su precisión es pobre (varios mg) y se verá interferida por el sulfato de amonio y Tris en la muestra, pero su precisión es alta y no se ve afectada por el tipo de proteína.
③Método folin fenol (Lowry)
El método folin fenol es una extensión del método biuret. Los reactivos utilizados constan de los reactivos A y B. El reactivo A es equivalente al reactivo de biuret (reactivo de cobre alcalino) y el reactivo B contiene ácido fosfomolíbdico y ácido fosfotúngstico.
En condiciones alcalinas, los grupos sulfhidrilo y fenol de la proteína pueden reducir el Cu2 a Cu. El Cu puede reaccionar cuantitativamente con el reactivo de folin-fenol para generar una sustancia azul. El contenido de proteína se puede medir colorimétricamente a 600 nm.
La sensibilidad es alta (alrededor de 0,1 mg), pero es problemática y también puede verse interferida por el sulfato de amonio y los compuestos de tiol. Preste especial atención a la mezcla de varios reactivos en el paso; de lo contrario, se producirán grandes errores.
④Método UV
Método de absorción de luz de 280 nm: utilice Tyr para absorber a 280 nm para la medición.
Método de diferencia de absorción de 280 nm-260 nm: si hay una pequeña cantidad de ácido nucleico en la solución de muestra, calcule de acuerdo con la siguiente fórmula:
Concentración de proteína (mg/ml) = 1.24E280-0.74 E260 (280 260 es la marca de la esquina)
⑤Método de unión de pigmentos (método Bradford)
Método de determinación directa: utilizando la combinación de moléculas de proteína y pigmento (Coomassie Brilliant Blue G-250) La absorción de luz se midió espectrofotométricamente.
El contenido de proteínas se determinó mediante tinción con azul brillante de Coomassie (CBG). El CBG es un poco como un indicador y cambia de color en diferentes niveles de pH; es té en condiciones ácidas y azul en condiciones neutras; Cuando el CBG se conecta a la proteína, se volverá azul porque la proteína proporcionará un entorno más neutro para el CBG. Cuando hay más proteína en la muestra, la proteína atrae más CBG y se realzará el color azul. Por tanto, la intensidad del color azul es directamente proporcional a la cantidad de proteína en la muestra.
Método de determinación indirecta: La proteína se combina con determinadas moléculas de pigmento ácidas o básicas para formar un precipitado salino insoluble. Utilice un espectrofotómetro para medir el pigmento no unido y exprese el contenido de proteína como la cantidad de pigmento unido por gramo de muestra.
⑥Método BCA
El método BCA (procedimiento del ácido bicinconínico, 4,4'-dicarboxi-2,2'-diquinolina) es similar al método de Lowry, la principal diferencia está en la alcalinidad En la solución, después de que la proteína convierte Cu2 en Cu, BCA se usa además para reemplazar el reactivo de Folin y se combina con Cu para producir un color púrpura intenso con una fuerte absorción a una longitud de onda de 562 nm.
Su ventaja es que el BCA en solución alcalina es más estable que el reactivo de Folin, por lo que la reacción de color de combinar BCA con una solución alcalina de iones de cobre solo necesita un paso para completarse. La sensibilidad es similar al método de Lowry.
Este método es más tolerante a los detergentes aniónicos, no iónicos y zwitteriónicos y a la urea, y es menos probable que interfiera, pero se verá interferido por los azúcares reductores y el EDTA.
⑦Método de determinación del oro coloidal
El oro coloidal es un hidrosol de ácido cloroáurico. Es magenta, tiene una alta densidad electrónica y puede interactuar con muchas combinaciones de macromoléculas biológicas.
El oro coloidal es un coloide hidrofóbico cargado negativamente que se vuelve azul cuando se expone a proteínas. El cambio de color está relacionado cuantitativamente con la proteína y puede usarse para la determinación cuantitativa de proteínas.
⑧Otros métodos
Algunas proteínas contienen grupos no proteicos especiales. Por ejemplo, la peroxidasa contiene grupos hemo, que se pueden cuantificar midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 403 nm. Las enzimas que contienen metales específicos, como el cadmio, pueden rastrear ese metal.