Notas
(1) Configuración del control de dos híbridos de levadura En la operación convencional de dos híbridos de levadura, generalmente se configuran tres tipos de controles: control positivo, control negativo y sistema cromogénico. control, tomando como ejemplo el sistema de detección de dos híbridos de levadura MATCHMAKER GAL4:
Control positivo: pGADT7-T + pGBKT7-53, en el que se ha confirmado que la proteína T y la proteína 53 pueden unirse. y activa el gen informador en células de levadura. Se expresan dos proteínas.
Control negativo: pGADT7-T + pGBKT7-lam, en el que queda claro que la proteína T y la proteína lam no pueden combinarse en las células de levadura. Sistema de control de color, pGADT7-Pcl1, este plásmido de expresión se transfiere a células de levadura para provocar la secreción de ?-galactosidasa y ?-galactosidasa, detectando así si hay un problema con el sistema de desarrollo de color.
(2) Fenómeno de falso positivo Hay muchas razones que pueden causar resultados falsos positivos, las tres más comunes son:
La proteína de la biblioteca analizada en sí tiene actividad transcripcional y puede activar el Expresión del gen informador: esta situación requiere la verificación de la autoactivación de las proteínas candidatas seleccionadas.
Las células de levadura pueden contener más de una biblioteca de proteínas al mismo tiempo, y una de las proteínas de la biblioteca puede unirse entre sí y con la proteína cebo.
En este caso, los clones positivos deben sembrarse en placas 2 o 3 veces nuevamente para garantizar que cada clon de levadura contenga solo una proteína de biblioteca y una proteína de cebo. Además, el número de veces en placas no debe ser demasiado; muchos, de lo contrario se puede perder el plásmido de expresión de proteínas. Algunos otros falsos positivos causados por razones desconocidas: en este caso, el plásmido de la biblioteca candidata seleccionado y el plásmido que expresa la proteína cebo deben volver a transfectarse en células de levadura o volver a verificarse mediante hibridación de levadura, si es necesario, pGADT7- Los vectores de. El plásmido de ADNc y el plásmido de cebo pGBKT7 se intercambiaron para construir cebo de pGADT7 y ADNc de pGBKT7 y se volvieron a verificar en células de levadura. La combinación verdaderamente positiva también puede producir resultados positivos en células de levadura después del intercambio.
(3) Problemas comunes y protocolos de referencia: la eficiencia de transformación es demasiado baja; intente utilizar medios de cultivo frescos y clones de levadura frescos con un diámetro de aproximadamente 2 ~ 3 mm para garantizar la viabilidad de la levadura; El plásmido usado para la transformación puede precipitarse con etanol antes de su uso para mejorar la pureza y concentración del plásmido.
La eficiencia de la hibridación es baja; puede deberse a la toxicidad de la proteína de fusión expresada para las células de levadura. En algunos casos, la levadura que no crece bien en un medio de cultivo líquido será reemplazada por un cultivo sólido de agarosa. placas Crece mejor. En este caso, puede utilizar el método de transformación *** para probar; o esparcir los clones de levadura transformados individualmente en cinco placas de cultivo de 10 mm. Después de que los clones crezcan, raspe todos los clones. en 5 ml de 0,5×YPDA. Después de la resuspensión, siga los procedimientos normales de hibridación. El fondo es demasiado alto: cuando se utiliza HIS3 como gen indicador, el fondo puede ser demasiado alto debido a un cierto grado de fuga de expresión del gen HIS3. En este caso, se necesita una cantidad adecuada de inhibidor competitivo de la proteína HIS3 3-AT (3). -amino) puede usarse. -1,2,4-triazol) para reducir el fondo o agregar una detección de gen indicador más estricta, como Ade;
La proteína cebo tiene un fenómeno de autoactivación: se pueden usar métodos de clonación y mutación para eliminar o mutar una secuencia de aminoácidos autoactivante, pero este método puede destruir la interacción entre las dos proteínas.