El sistema de dos híbridos de levadura fue establecido por primera vez por Fields y Song para estudiar la regulación de la transcripción de genes eucarióticos. Los factores de transcripción eucariotas típicos, como GAL4, GCN4, etc., contienen dos dominios diferentes: dominio de unión al ADN y dominio de activación de la transcripción. El primero puede reconocer secuencias específicas en el ADN y posicionar el dominio de activación de la transcripción aguas arriba del gen que regula. El dominio de activación de la transcripción puede interactuar con otros componentes del complejo de transcripción para iniciar la transcripción del gen que regula. Ambos dominios no sólo pueden abrirse en el lugar apropiado de su región de conexión, sino que también tienen sus propias funciones. Además, los dos dominios diferentes pueden reconstituirse para ejercer efectos de activación transcripcional.
Nombre chino
Principio del sistema de dos híbridos de levadura
Tipo
Principio del sistema
Como
GAL4
Inglés
Dominio activador de ADN
Navegación rápida
Aplicación de ventajas
p>Vector de clase II
El sistema de dos híbridos de levadura utiliza genes híbridos para detectar interacciones proteína-proteína activando la expresión de genes informadores. Hay dos tipos principales de vectores: a. Vectores que contienen un dominio de unión al ADN; b. Cuando se construyen genes de fusión con los dos tipos de vectores anteriores, el gen de la proteína de prueba y el gen del dominio deben fusionarse dentro del marco de lectura. El gen de fusión se expresa en la cepa indicadora y su producto de expresión sólo puede impulsar la transcripción del gen indicador si está localizado en el núcleo. Por ejemplo, GAL4-bd tiene una secuencia de localización nuclear, pero GAL4-ad no. Por lo tanto, se debe clonar una secuencia del antígeno T de SV40 en el extremo amino o carboxilo de GAL4-ad como una secuencia de localización nuclear.
Ventajas
Otro componente importante del sistema de dos híbridos es la variedad reportera. La cepa informadora se refiere a una célula huésped modificada que contiene un plásmido recombinante que contiene un gen informador.
Las células de levadura más utilizadas son las células de levadura. El sistema de dos híbridos de células de levadura como cepas reporteras tiene muchas ventajas:
<1>Es fácil de transformar y recuperar. el plásmido amplificado.
<2>Posee genes marcadores y genes reporteros característicos que pueden seleccionarse directamente.
<3>Las proteínas endógenas de la levadura no son fáciles de combinar con proteínas derivadas de mamíferos.
Generalmente, un gen que codifica una proteína se fusiona con el dominio de unión al ADN de un regulador transcripcional claro (como GAL4-bd, LexA-bd); como GAL4-ad, VP16).
El gen de fusión del dominio de activación se transfiere a una línea celular de levadura que expresa el gen de fusión del dominio de unión. La interacción entre proteínas provoca la reconstrucción del factor de transcripción y conduce a la expresión de genes indicadores adyacentes (como por ejemplo). lacZ), para que se pueda analizar el efecto de unión entre las proteínas.
Aplicación
El sistema de dos híbridos de levadura puede medir la unión de proteínas in vivo y es muy sensible.
Principalmente debido a:
① Utilizar un vector de expresión con alto número de copias y un promotor fuerte para sobreexpresar la proteína híbrida.
② La medición de la señal se lleva a cabo en condiciones de concentración de equilibrio natural. Sin embargo, los métodos físicos como la inmunoprecipitación requieren múltiples lavados para lograr esta condición, lo que reduce la intensidad de la señal.
③La estabilidad de las proteínas híbridas se puede mejorar mediante la combinación del dominio de activación y el dominio de unión para formar un complejo de iniciación de la transcripción, que a su vez se une al ADN promotor. Este complejo ternario permite que cada grupo. La combinación de puntos tiende a ser estable.
④Se produce una variedad de enzimas estables a través del ARNm para amplificar la señal. Al mismo tiempo, los métodos de detección como el fenotipo de levadura, la expresión de la proteína X-Gal y HIS3 son todos muy sensibles.