Con el continuo desarrollo de la investigación en biología molecular y biología celular, la transfección se ha convertido en una herramienta rutinaria para estudiar y controlar las funciones genéticas en células eucariotas. Su aplicación está cada vez más extendida en experimentos biológicos como el estudio de la función genética, la regulación de la expresión genética, el análisis de mutaciones y la producción de proteínas.
1. Clasificación de la transfección: tres tipos de vías: mediada física, mediada química y mediada biológica.
Mediación física: electroporación, microinyección y pistola genética.
Mediación química: método clásico de precipitación con fosfato cálcico, método de transfección de liposomas y tecnologías mediadas por una variedad de sustancias catiónicas;
Mediación biológica: la transfección de protoplastos relativamente primitiva y varias tecnologías de transfección mediadas por virus que ahora son más comunes.
2. Una introducción detallada a los tres métodos de transfección:
El método de electroporación perfora temporalmente las células durante un corto período de tiempo para permitir la entrada de plásmidos extraños (las condiciones experimentales son más estrictamente controlado y más difícil);
El método de los liposomas utiliza diferentes materiales portadores para transportar plásmidos y permitir que genes extraños ingresen a las células a través de la penetración directa o la fusión de membranas (de uso común, la proporción de plásmidos a plásmidos, La densidad celular, la duración del tiempo de transfección y el contenido de suero en el medio de cultivo afectan la eficiencia de la transfección);
El método del virus es un método para infectar células con virus que empaquetan genes extraños para que puedan entrar en las células (la preparación preliminar es más complicada, puede tener un mayor impacto en las células);
3. Plásmido: una unidad genética que puede replicarse de forma autónoma fuera del núcleo de las células eucariotas o de la región nucleoide de las procariotas. .
Incluyendo orgánulos eucariotas (principalmente mitocondrias y cloroplastos) y moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) cíclico fuera de la región nucleoide de las células bacterianas.
Los plásmidos se utilizan a menudo como vectores genéticos en ingeniería genética. Los plásmidos suelen contener genes de resistencia a los antibióticos, como genes de resistencia a la ampicilina o genes de resistencia a la kanamicina.
4. Transfección viral: Los genes extraños se integran eficazmente en el cromosoma del huésped para lograr una expresión persistente. Se puede utilizar para ARNi, clonación de ADNc e investigación de genes indicadores, detección de líneas celulares transducidas de forma estable y experimentos con modelos animales in vivo.
El sistema de empaquetado de vectores lentivirales generalmente consta de dos partes, a saber, componentes de empaquetado y componentes de vector. El primero puede proporcionar proteínas necesarias para la producción de partículas virales en trans; el segundo también tiene un sitio de clonación múltiple bajo el control de un promotor heterólogo y un gen diana insertado en este sitio.
Pasos: 1) Construir el vector 2) Empaquetar y purificar el virus 3) Infectar las células diana
Para producir partículas de virus de alto título, es necesario utilizar un vector de expresión y un plásmido empaquetador. simultáneamente*** Transfecte las células y empaquete el virus en las células. Las partículas pseudovirales empaquetadas se secretan en el medio extracelular. Después de la centrifugación para obtener el sobrenadante, se puede utilizar directamente para infectar las células huésped. , después de la transcripción inversa, se integra en el genoma, expresando así moléculas efectoras de alto nivel.
5. Similitudes y diferencias entre la transfección de plásmidos y la infección viral:
(1) Transfección de plásmidos: un método relativamente simple de entrega de genes, que es diferente de la forma en que los vectores virales atacan activamente e infectar células. La transfección de plásmidos es un tipo de difusión pasiva.
Ventajas: El proceso de construcción del vector plasmídico es relativamente simple y rápido (los vectores virales deben construirse primero y luego empaquetarse en partículas virales)
Desventajas: a. transfección de plásmidos La eficiencia es inestable. Diferentes células utilizan diferentes métodos de transfección y medios de transfección, por lo que la eficiencia varía mucho y la mayoría de los métodos no son eficientes;
b. En medios como liposomas catiónicos y polímeros catiónicos, la eficiencia de la electrotransfección de plásmidos en el núcleo es mucho mayor que la de la transferencia de medios, pero en comparación con la transfección lentiviral, la eficiencia sigue siendo mucho menor y causa un mayor daño a las células.
(2) Transfección de vectores virales: las partículas de virus son capas de virus (median la transducción celular/introducción de integrasa/median la transducción dirigida in vivo) y complejos de genes diana, sin o con reactivos simples pueden completar la introducción de genes.
Ventajas: Se puede lograr una alta eficiencia de transfección y una transducción eficiente y estable de células y animales mediante el uso de diferentes herramientas de vectores virales.
Desventajas: el empaquetado de diferentes vectores virales requiere procesos relativamente complejos y optimización de procesos, y el umbral técnico es relativamente alto.