La isquemia cerebral pertenece a la categoría de accidente cerebrovascular y es una enfermedad clínica común con alta morbilidad, mortalidad y discapacidad. las características de alta tasa y pone en grave peligro la salud humana. Hasta el momento, en el país y en el extranjero todavía faltan fármacos quimioterapéuticos eficaces para el tratamiento de la isquemia cerebral y sus secuelas. La medicina basada en la evidencia muestra que la medicina tradicional china tiene ciertas ventajas en el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico. Actualmente, una gran cantidad de investigaciones se centran en el efecto protector de la medicina tradicional china sobre la lesión isquémica cerebral aguda. Sin embargo, la recuperación funcional después de una isquemia cerebral es un proceso largo y rara vez se ha estudiado durante mucho tiempo. La decocción Buyang Huanwu es una receta clásica para tratar el accidente cerebrovascular isquémico y sus secuelas. Proviene de "Yilin Gaicao" escrito por Wang Qingren en la dinastía Qing. Esta prescripción se utiliza ampliamente en la clínica y tiene un efecto curativo definido, pero es necesario dilucidar más su mecanismo para promover la recuperación de la función neurológica. Este artículo utiliza el método de oclusión de la arteria cerebral media para replicar el modelo de isquemia cerebral focal en ratas y explora el efecto protector a largo plazo de la decocción Buyang Huanwu sobre su función neurológica, con el fin de proporcionar una base experimental para la medicación clínica del accidente cerebrovascular isquémico.
1 Materiales
1.1 Ratas SD macho de salud animal, 189, grado SPF, peso 260 ~ 280 g, compradas en Hunan Slaike Jinda Experimental Animal Co., Ltd., certificado de licencia de producción número SCXK (Hunan) 2009-0004, número de certificado de animal 004535.
1 receta. 2 La decocción Buyang Huanwu proviene del "Lin Yi Gaicuo" de Wang Qingren, que consta de 120 g de Astragalus membranaceus, 4,5 g de raíz de peonía roja, 3 g de rizoma de Chuanxiong, 6 g de Guiwei, 3 g de lombriz de tierra seca, 3 g de cártamo y 3 g de semilla de melocotón, los materiales medicinales cumplen con la edición de 2005 de la Farmacopea China. Preparación de la decocción de Buyang Huanwu: Remoje las rodajas en agua durante 30 minutos. Agregue los materiales medicinales y 5 veces la cantidad de agua bidestilada para la primera decocción, y cocine durante 60 minutos. Agregue 5 veces la cantidad de agua bidestilada. para la segunda decocción agua, decocción durante 60 minutos, mezclar las dos decocciones uniformemente, concentrar para contener 2 g·mL-1 del fármaco crudo, refrigerar para uso posterior.
1.3 Reactivos hidrato de cloral al 10% (Yangzhou Aoxin Auxiliary Factory), paraformaldehído (Changsha Jinhua Chemical Co., Ltd.), TTC (Sigma Red Tetrazol Company).
1.4 Instrumentos Microscopio óptico Bx51 y sistema de análisis de imágenes IPP5.1 (Olympus, Japón), balanza electrónica FA (Shanghai Taizhiheng Electronic Scale Co., Ltd.), destilador doble de agua pura totalmente automático (Shanghai Glass Instrument Fábrica No. 1), microtomo Finesse 325 (British Mountain Road).
2 métodos
2.1 Agrupación y administración Las ratas se dividieron aleatoriamente en un grupo de operación simulada, un grupo modelo y un grupo de decocción Buyang Huanwu, con 63 ratas en cada grupo. Cada grupo de animales se dividió en tres momentos, a saber, 7, 14 y 21 días después de la primera dosis, con 21 animales en cada momento. Los animales del grupo de decocción de Buyang Huanwu comenzaron a tomar el medicamento 2 horas después de la operación, la dosis fue de 5 g·kg-1d-1, ig una vez, una vez al día. El grupo modelo y el grupo de operación simulada recibieron volúmenes iguales de agua destilada.
2.2 Preparación del modelo y evaluación Referencia: Modelo de rata con isquemia cerebral focal replicada por oclusión de la arteria cerebral media: anestesia IP con hidrato de cloral al 10 % (3 ± 3,5 ml kg-1). La incisión de la línea media en el cuello mide aproximadamente 3 cm de largo, se separa capa por capa, se liga la arteria carótida externa, se pinza la arteria carótida interna y luego se liga la arteria carótida común, aproximadamente debajo de la bifurcación de la arteria carótida común. En el grupo de operación simulada, solo se hizo una incisión en la piel, se separó la arteria carótida común izquierda y luego se suturó. Después de la cirugía, los animales fueron colocados en un terrario con un acolchado limpio y tuvieron libre acceso a agua y comida. Después de despertarse durante 2 horas, los animales fueron calificados según la escala de cinco puntos de Longa y Bederson, y aquellos con puntuaciones de 1 a 3 se incluyeron en el grupo. 0: Sin síntomas de daño nervioso; 1 punto: La pata delantera contralateral no puede extenderse completamente; 2 puntos: Girar hacia el lado opuesto; 3 puntos: Caer hacia el lado opuesto; 4 puntos: Incapaz de caminar de forma independiente, pérdida del conocimiento; Cuanto mayor sea la puntuación, más grave será el déficit neurológico y viceversa. Criterios de exclusión: puntuación inferior a 1; hemorragia subaracnoidea; tinción HE que no muestra cambios patológicos de muerte cerebral antes de tiempo; La muerte y otros animales serán reemplazados aleatoriamente cuando no haya suficientes animales.
2.3 Detección del índice
2.3. Utilice 1 método de tinción TTC para medir la proporción del área de infarto cerebral de 5 ratas en cada grupo en cada momento. Después de la anestesia con hidrato de cloral al 10%, los cerebros se extrajeron por decapitación y se congelaron a -20°C durante 20 minutos. Se cortó una rebanada cada 2 mm desde el polo frontal.
El primer cuchillo está en el punto medio de la línea que conecta el polo anterior del cerebro y el quiasma óptico; el segundo cuchillo está en el quiasma óptico; el tercer cuchillo está en el mango infundibular; el cuarto cuchillo está entre el mango infundibular y el; polo caudal del lóbulo posterior, con ***A, B, C, D y e, 5 cortes, teñidos con tetrazolio rojo al 2%, protegidos de la luz a 37°C durante 30 minutos, el tejido normal es rojo oscuro y El tejido infartado es blanco. Después de tomar fotografías, seleccione el área de infarto del corte isquémico C más grande, escanéela y calcule con el sistema de análisis de imágenes Image-Pro Express y exprese el porcentaje del área de infarto en el área total del cerebro del corte C. Para eliminar el error causado por el edema cerebral en el hemisferio infartado, se calculó el porcentaje del área del infarto en el corte C utilizando el método de Swanson después de la corrección. es =(s 1-Sr)/2s 1×100% s 1: área total del lado sano en corte C Sr: área no infartada del lado afectado en corte C;
2.3.② Puntuación de la función nerviosa: 10 ratas en cada grupo en cada momento se realizó la puntuación de la función nerviosa 2 horas después de la cirugía y 1 hora antes del sacrificio de los animales.
2. 3. Se utilizó tinción con HE para observar los cambios histopatológicos del hipocampo y la corteza, 6 animales por grupo en cada momento. Utilice el mismo método que 2. 3.1. La parte posterior del cerebro se fijó con paraformaldehído al 4% durante 24 horas, se deshidrató con etanol graduado y se embebió en parafina convencional. El cerebro se seccionó en serie (espesor de 5 micrones). Las secciones que contenían hipocampo se fijaron a portaobjetos de vidrio y se tiñeron. con He, y se observaron bajo un microscopio óptico. Se compararon los cambios morfológicos y patológicos del hipocampo izquierdo y las células del tejido cortical en cada grupo.
2.4 Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como x±s y los datos se analizaron estadísticamente utilizando SPSS 19. 0. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional para la comparación entre grupos, los resultados de P
3
3 compararon el área del infarto cerebral en el grupo 1 y el grupo de operación simulada. Estaba teñido uniformemente de un rojo intenso. El grupo modelo 7, 14, 21 D y el grupo de decocción Buyang Huanwu se tiñeron de manera desigual, y el área de infarto local era blanca y el área de infarto estaba alrededor de la corteza parietal isquémica y el hipocampo. El análisis del área de infarto mostró que el área de infarto del grupo modelo y del grupo de decocción Buyang Huanwu disminuyó gradualmente con el tiempo (P
3.2. Las puntuaciones de función neurológica de cada grupo en cada momento fueron 0 puntos en el grupo de operación simulada; el grupo de suplementación La puntuación de la función neurológica del grupo de Decocción de Yanghuanwu fue menor que la del grupo modelo, y la diferencia fue estadísticamente significativa (P <05).
3.3 Cambios morfológicos en el hipocampo y la corteza de cada grupo
3.3.1 La morfología del hipocampo en el grupo de operación simulada fue normal, con contornos celulares claros, tinción nuclear uniforme, disposición ordenada de las células y tinción intersticial uniformemente. Las neuronas del hipocampo en los grupos modelo de 7, 14 y 21 días se redujeron, los núcleos eran picnóticos, los bordes nucleares eran severos, aparecieron vacuolas en las células, la forma de las células cambió de elipse a huso y triángulo, la distancia intercelular aumentó, la intersticial las manchas eran escasas y había agujeros. En comparación con el grupo modelo, el número de células vacuoladas en el hipocampo del grupo de decocción Buyang Huanwu en los días 7, 14 y 21 se redujo significativamente, la morfología celular mejoró significativamente y la disposición celular fue más ordenada que la del grupo modelo. grupo modelo. Los días 7 y 14, algunos núcleos celulares en el grupo de decocción de Buyang Huanwu todavía estaban profundamente teñidos y mostraban cambios similares a vacuolas, pero la morfología de las células del hipocampo en el grupo de decocción de Buyang Huanwu era cercana a la del grupo de operación simulada.
3.3.2 Las células corticales en el grupo de operación cortical simulada tenían morfología normal, bordes claros, disposición ordenada, forma completa y tinción uniforme de los núcleos celulares y la matriz intercelular. En los días 7, 14 y 21, las células isquémicas en el grupo modelo mostraron necrosis vacuolar, pérdida de morfología celular, espacios intercelulares agrandados, tinción más clara y cambios reticulares; las células restantes se redujeron de tamaño, los núcleos se concentraron y se tiñeron profundamente; y los límites de las celdas no estaban claros. En comparación con el grupo modelo en el mismo período, el número de células vacuoladas en las células corticales del grupo de decocción Buyang Huanwu se redujo significativamente, la morfología celular mejoró significativamente, las células estaban dispuestas ordenadamente, los núcleos eran más claros y las intercelulares la tinción fue más uniforme.
4 Discusión
La isquemia cerebral focal, también conocida como accidente cerebrovascular isquémico, es el tipo clínico más común de enfermedad cerebrovascular. Está causada por la obstrucción del suministro de sangre al cerebro, lo que provoca. al daño cerebral. La isquemia tisular y la hipoxia provocan infarto cerebral y necrosis en el área correspondiente, pérdida de una gran cantidad de neuronas y los correspondientes síntomas y signos de déficit neurológico. En la actualidad, los métodos de la medicina occidental para tratar la isquemia cerebral incluyen principalmente trombólisis, anticoagulación, reducción de fibra, vasodilatación, oxígeno hiperbárico, terapia intervencionista, terapia génica, trasplante de células madre neurales, etc., que aún se encuentran en la etapa de experimentación con animales. Entre estos métodos de tratamiento, a excepción del tratamiento trombolítico ultratemprano (dentro de las 3 horas posteriores al inicio), la tasa efectiva alcanza entre el 21% y el 93%, y los efectos de otros métodos de tratamiento son inciertos. Además, debido a su estricta ventana de tiempo, la terapia trombolítica significa que menos del 5% de los pacientes tienen la oportunidad de someterse a este tratamiento. Por lo tanto, alrededor del 80% de los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico dejarán diversos grados de secuelas: déficits neurológicos.
El ictus isquémico típico se puede dividir en tres etapas según el curso de la enfermedad. Fase aguda 1, dentro de 1 mes después del ictus; segunda fase de recuperación, dentro de los 2 a 6 meses posteriores al ictus; secuelas de la fase 3, 6 meses después del ictus; La decocción de Buyang Huanwu se utiliza principalmente para el tratamiento del período de recuperación y las secuelas de la isquemia cerebral. Es el fármaco de primera elección para el tratamiento de las secuelas de la isquemia cerebral y tiene una eficacia clínica notable. Por tanto, en experimentos con animales, el tiempo de observación más largo es de 21 días después de la isquemia, lo que equivale a las secuelas de la isquemia cerebral humana. En este estudio experimental, los resultados de la puntuación de la función neurológica mostraron que la decocción Buyang Huanwu puede promover la recuperación de la función neurológica en ratas después de una isquemia cerebral. Los académicos creen que su mecanismo de acción es promover la angiogénesis, dilatar los vasos sanguíneos, anticoagular y trombólisis, mejorar la microcirculación local en la isquemia cerebral, reducir el edema cerebral y el daño de los radicales libres de oxígeno, proteger el tejido cerebral y, por lo tanto, promover la recuperación de la función neurológica. . La investigación de nuestro laboratorio y otros laboratorios nacionales ha demostrado que la decocción Buyang Huanwu puede promover la proliferación, migración y diferenciación de células madre neurales en el cerebro después de la isquemia, que puede ser uno de los mecanismos por los cuales promueve la recuperación de la función neurológica después de la isquemia. . Al comparar la proporción del área de infarto cerebral de los animales en cada grupo, los resultados mostraron que el área de infarto cerebral del grupo de decocción de Buyang Huanwu era significativamente menor que la del grupo modelo al mismo tiempo. Las posibles razones son: 1. La decocción de Buyang Huanwu desempeña un papel protector en el cerebro durante la isquemia cerebral aguda, inhibe la muerte y la apoptosis de una gran cantidad de neuronas y reduce el área del infarto; en segundo lugar, la decocción de Buyang Huanwu promueve la función cerebral; después de la isquemia, la regeneración, reparación y compensación del tejido dan como resultado un área de infarto más pequeña que el grupo modelo correspondiente, también es posible tener ambos. Además, al comparar los cambios histológicos en el hipocampo y la corteza después de la isquemia entre el grupo de decocción de Buyang Huanwu y el grupo modelo, los resultados mostraron que la decocción de Buyang Huanwu puede mejorar significativamente la morfología y la disposición de las células después de una lesión por isquemia cerebral y promover la reparación de tejidos.
En resumen, este estudio confirma que la decocción Buyang Huanwu tiene el efecto protector del cerebro al reducir las puntuaciones de la función neurológica de la isquemia cerebral, reducir el área del infarto cerebral y mejorar la morfología y disposición de las células del tejido cerebral. falta en el tratamiento clínico. El accidente cerebrovascular hemorrágico proporciona una base experimental sólida.
;