Los pasos de construcción de vectores plásmidos se presentan a continuación:
Proceso de construcción del vector: 1. Diseño de cebadores 2. Selección de segmentos: extracción de ARN, transcripción inversa de ARN, amplificación por PCR, producto de PCR purificación 3. Digestión con doble enzima 4. Conexión: Conexión de ADN ligasa T4 o conexión de recombinación homóloga (nuevos productos: #B101, #B102) 5. Transformación 6. PCR de colonias 7. Secuenciación: 1) Agitar bacterias 2) Enviar muestras 3; ) Emparejamiento; 8. Preservación de cepas: si el emparejamiento de cepas es exitoso, las cepas se pueden guardar para referencia futura. 9. Extracción de plásmidos: las cepas bacterianas se emparejan con éxito. Después de congelar las cepas, el líquido bacteriano está listo para extraer los plásmidos. , Principios básicos de la construcción de vectores
Separar, cortar, conectar, transferir y seleccionar
1. Separar: aislar el gen y el vector a clonar.
2. Corte: La endonucleasa de restricción corta los genes y vectores para producir extremos que sean convenientes para la ligadura.
Endonucleasa de restricción: Es un tipo de nucleasa que puede reconocer secuencias de bases específicas en el ADN bicatenario.
Las endonucleasas de restricción se dividen en tres categorías en función de sus características de reconocimiento y escisión, condiciones catalíticas y si tienen actividad enzimática modificadora.
Las enzimas de tipo II pueden reconocer la secuencia específica de ADN bicatenario y cortar dentro de esta secuencia para producir fragmentos de ADN específicos. Son enzimas comúnmente utilizadas en la tecnología de recombinación de ADN.
Enzima tipo Ⅰ: tiene funciones de modificación y corte, sitio de escisión fijo
La enzima tipo Ⅲ es similar a la tipo Ⅰ y puede reconocer sitios específicos, pero el sitio de escisión está en el sitio de reconocimiento Más allá del punto
Características de las enzimas tipo II:
①La secuencia de reconocimiento es generalmente de 4 a 6 pares de bases.
②La secuencia de reconocimiento tiene una propiedad de simetría rotacional de 180 grados. , que muestra una estructura de bucle completa
③La enzima tipo II corta ambas hebras de ADN bicatenario al mismo tiempo y puede producir dos extremos diferentes: extremos romos y extremos pegajosos
Extremos romos: En el eje de simetría de la secuencia de reconocimiento, el ADN se corta simultáneamente para formar extremos romos, como: SmaI
5'-CCC GGG-3'
5'-CCC
GGG-3'
3'-GGG CCC-5'
3'-GGG
CCC-5'
Extremo adhesivo que sobresale 5': corte las dobles hebras de ADN en ambos extremos de la secuencia de reconocimiento y corte en el extremo 5' del eje de simetría para producir un extremo adhesivo que sobresale 5', como por ejemplo: Hind III
5' ―AAGCTT―3'
5'― A
5'―AGCTT―3'
3'―TTCGAA―5'
3'- TTCGA-5'
A-5'
Extremo adhesivo sobresaliente de 3': A diferencia del extremo adhesivo sobresaliente de 5', el extremo adhesivo sobresaliente de 3' 'Se produce un extremo pegajoso que sobresale, como por ejemplo: PstI
5'-CTGCAG-3'
5'-CTGCA-3'
G-3'
3'-GACGTC-5'
3'-G
3'-ACGTC-5'
3. cortar el gen de? Conectar con el vector T4 ADN ligasa o método de recombinación homóloga.
①Fuente: La ADN ligasa T4 es el producto codificado por el gen 30 del fago T4. Se extrajo por primera vez de enterobacterias infectadas con el fago T4. El peso del componente es 68 KD.
②El pH óptimo es 7,2-7,8, y la solución de reacción habitual es Tris-Hcl con pH 7,6
③Se requiere ATP como cofactor y la energía la proporciona el ATP
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④Los compuestos de sulfhidrilo como el DTT pueden promover la acción de ligación de la ligasa
⑤Las concentraciones de sodio, potasio, etc. inhiben la actividad enzimática
4. la ligasa El proceso de transformación de células competentes con buenos vectores recombinantes (bacterias: E. coli, hongos: levaduras, células de Kun o células de mamíferos).
5. Screening: Screening a diferentes niveles y niveles para identificar los recombinantes específicos requeridos. Se utilizan varios métodos para seleccionar las bacterias huésped que portan el vector recombinante del medio de cultivo. Por ejemplo: vector, resultados de digestión enzimática, marcadores de detección, etc.